Nature Plants 9권, 128~141페이지(2023)이 기사 인용
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박테리아는 질병을 촉진하는 세포 과정을 조작하기 위해 숙주 세포에 이펙터 단백질을 주입합니다. 박테리아는 표적 숙주 세포에만 극소량의 효과기를 전달하기 때문에 대량 감염된 숙주 조직에서 효과기 의존성 세포 변화를 포착하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서 우리는 Xanthomonas 박테리아 이펙터를 받은 Arabidopsis 식물 세포에서 핵의 친화도 기반 정제를 용이하게 하는 특정 세포 유형에 태그된 핵의 이펙터 유도성 분리(eINTACT)라는 새로운 기술을 보고합니다. 정제된 핵을 분석한 결과 Xanthomonas effector XopD가 Arabidopsis 앱시스산 신호 전달 관련 유전자의 발현을 조작하고 삼투압 스트레스에 반응하여 기공 폐쇄에 필요한 칼슘 투과 채널을 코딩하는 유전자인 OSCA1.1을 활성화하는 것으로 나타났습니다. OSCA1.1의 손실은 잎 시들음을 유발하고 감염된 잎에서 박테리아 성장을 감소시키며, 이는 OSCA1.1이 숙주 감수성을 촉진한다는 것을 시사합니다. eINTACT를 통해 XopD가 호스트 OSCA1.1/abscisic acid 삼투 신호 전달 매개 기공 폐쇄를 활용하여 박테리아 성장을 선호하는 습한 서식지를 만들고 자생 식물의 수많은 그람 음성 식물 박테리아의 이펙터 기능을 정확하게 설명하기 위한 새로운 길을 열어준다는 사실을 밝힐 수 있습니다. 감염 상황.
세균성 병원체는 자연 개구부(예: 기공 또는 포낭) 또는 상처를 통해 숙주 식물에 유입된 후 세포 사이 또는 혈관 내 이형성 공간에서 증식합니다1,2. 감염을 촉진하기 위해 악성 그람 음성 박테리아는 주사기 모양의 다중 단백질 복합체인 III형 분비 시스템(T3SS)3을 사용하여 이펙터를 숙주 세포에 주입합니다. 숙주 세포 내부에서 이펙터는 특정 세포하 구획에 국한되고 숙주 세포 과정을 조작하여 숙주 면역을 억제하거나 박테리아 성장 또는 분산을 선호하는 환경을 조성합니다4,5. 박테리아 병원체에 대한 최근 연구에 따르면 식물에 수성 이형성 공간을 확립하는 것이 박테리아 병독성에 중요합니다. 실제로 Pseudomonas syringae HopM16, Xanthomonas gardneri AvrHah17 및 Xanthomonas translucens Tal88과 같은 감염된 조직의 수분 수준을 증가시켜 질병을 촉진하는 몇 가지 이펙터가 확인되었습니다. 계통 발생적으로 구별되는 박테리아 속의 이펙터의 다양성으로 인해 이펙터 매개 식물 감수성의 기본 분자 메커니즘은 여전히 대체로 수수께끼로 남아 있습니다.
Xanthomonas campestris pv. campestris 균주 8004(Xcc8004)는 많은 브라시카 작물과 모델 식물인 Arabidopsis2에서 흑색부패병을 일으키는 잎 혈관 병원체입니다. 이펙터 단백질 중 하나인 Xanthomonas 외부 단백질 D(XopDXcc8004, 이 연구에서는 XopD)는 3개의 N 말단 식물 특이적 에틸렌 반응 요소 결합 인자 관련 양친매성 억제(EAR)를 포함하는 핵에 국한된 유형 III 이펙터 단백질입니다. 일반적으로 planta 및 C 말단 시스테인 프로테아제 도메인에서 전사 침묵을 중재하는 모티프9(확장 데이터 그림 1). 흥미롭게도 이전의 두 연구에서는 Arabidopsis10,11에서 XopD의 뚜렷한 활동을 보고했습니다. 한 연구에 따르면 XopD는 초기 잎 괴사를 억제하여 질병을 촉진하지만 감염된 애기장대 잎의 박테리아 성장에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. EAR 모티프 함유 도메인을 통해 XopD는 지베렐린산(GA) 반응 유전자의 주요 전사 억제자인 Arabidopsis DELLA 단백질과 상호 작용하고 안정화합니다. 그러나 XopD-DELLA 상호작용은 GA 반응 전사체 수준에서 감지 가능한 변화를 일으키지 않습니다. 논란의 여지가 있지만, 또 다른 연구에서는 애기장대에서 β-에스트라디올 유도성 프로모터의 제어 하에 XopD의 형질전환 발현이 살리실산(SA) 의존적 방어 반응을 유발하고 박테리아 성장을 억제함에 따라 XopD의 비독성 효과를 추론했습니다. 또한, 작은 유비퀴틴 유사 수정자(SUMO) 프로테아제 활성을 갖는 XopD는 시험관 내에서 피토크롬 신호 전달에 관여하는 전사 인자(TF)인 Arabidopsis HFR1과 상호 작용하고 SUMOylate하는 것으로 밝혀졌습니다. 종합적으로 말하자면, 이전의 두 연구는 XopD가 식물 TF의 활동과 숙주 식물 호르몬 신호 전달 경로를 조절할 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 XopD의 정확한 planta 기능을 뒷받침하는 분자 메커니즘은 아직 결정적이지 않습니다.
2) enriched biological GO terms. The DEGs that were not annotated by these GO terms were not shown. c, WashU Epigenome Browser snapshots showing mCG and mCHH methylation levels at SUVH9 and OSCA1.1 loci. Positive and negative bars indicate 5-methylcytosine levels of single cytosine on the Watson (+1) and Crick (−1) strands, respectively. The transposable elements (TEs) are shown as grey boxes. The transcription start site (TSS) is indicated with a brown triangle. d,e, The expression levels (mean read counts) of OSCA1.1 (d) and PR1, PR2, PR5, EDS1 and PAD4 (e) in nuc−XopD and nuc+XopD. Data are presented as mean values ± s.e.m. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. DESeq2 P values are from Wald test corrected for multiple testing using the Benjamini–Hochberg method (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0.033; PR1, P = 0.819; PR2, P = 0.947; PR5, P = 0.794; EDS1, P = 0.833; PAD4, P = 0.981). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). f, Relative expression of XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 and HYL1 after XopD was induced by β-estradiol in Arabidopsis seedlings, relative to their expression in DMSO-treated seedlings. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.e.d. (error bars) from n = 2 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (DMSO-treated seedlings versus β-estradiol-treated seedlings; XopD, P = 0.04; PR1, P = 0.04; PR2, P = 0.03; OSCA1.1, P = 0.42; HYL1, P = 0.15). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). Small circles indicate data points of individual biological replicates (d–f)./p> 0.05). b, RT-qPCR analysis of RD29A expression in nuc+XopD relative to its expression in nuc−XopD. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (P = 0.043). *P < 0.05. c, Relative abundances of miR159a in nuc−XopD and nuc+XopD compared to its abundance in total nuclei of mock-inoculated leaves. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates and normalized against the abundances of ACTIN2/8 in each sample. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (nuc−XopD versus nuc+XopD, P = 0.019). *P < 0.05. d, Representative leaves infected with indicated bacterial strains under regular (60%) or high (95%) humidity conditions at seven DPI. Mock, treatment with buffer; ABA, treatment with ABA. e, The water loss rate of detached Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) infected leaves at seven DPI. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 8 leaves from four different plants. f, A boxplot representing bacterial population density in symptomatic leaf tissues inoculated with Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) at seven DPI. Horizontal lines from the top show maxima, upper quartile, median, lower quartile and minima values, and cross marks show the mean values. For each treatment, n = 8 leaves from four different plants were examined. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (no treatment: Xcc∆xopD* inoculated leaves versus Xcc* inoculated leaves, P = 0.046; Xcc∆xopD* inoculated leaves: mock treatment versus ABA treatment, P = 0.014). *P < 0.05. Small circles (a–c,f) represent data points of individual biological replicates./p>six-fold) lower in nuc+XopD (Fig. 4c), which coincided with a significant increase in MYB33 expression in these nuclei (Fig. 4a)./p> 5, false discovery rate (FDR) adjusted P value < 0.05, |log2FC| > 1)47./p>96% methylated pUC19 DNA spiked in) was sheared to 100–500-bp fragments using a focused ultrasonicator (Covaris E220 system), in microtubes at a setting of 175 peak incident power, 10 dc, 200 cpb for 40 s. Enzymatic methyl-sequencing (EM-seq) libraries were prepared from sheared DNA using NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit following the manufacturer instructions (New England BioLabs). Due to the amount of starting DNA material being lower than 10 ng, the minimum recommended amount of starting material by the manufacturer, we added two PCR cycles at the final step of PCR amplification of the sequencing libraries. Libraries were sequenced on NovaSeq 6000 system (Novogene) for collecting 2× 150-bp paired-end reads that passed the Illumina quality control filter (Supplementary Table 8)./p>100 bp, mean methylation difference >0.15, test statistic areaStat >10. A locally installed WashU Epigenome Browser was used for visualizing DNA methylation at single-base resolution54./p>2) sample types were analysed by ANOVA followed by post hoc Tukey’s honestly significant difference. Experiments were performed at least twice with similar results./p> 0.05)./p> 0.05)./p> 0.05)./p> 0.05)./p>
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